Журнал. Вестник офтальмологии № 6 — 2020 г.

Оригинальные статьи

Original articles

Клетки грибов С. albicans организованы в кластеры, имеют округлую форму, размер клеток составляет от 2 до 6 мкм (см. рис. 1, л, рис. 2). Среднее значение относительной активности ме­ таболизма клеток контрольных образцов находится в диапазоне 40—50 уел. ед. для S. aureus и P. aeruginosa. Для С. albicans данный показатель составляет 63,5 уел. ед. (см. рис 2). Число клеток с активными эффлюкс-системами не превышает 5 и 20% для P. aeruginosa и S. aureus со­ ответственно (см. рис. 2). Объем выборки в каждом случае составлял несколько сотен индивидуальных замеров: при исследовании метаболической активно­ сти на культуре S. Aureus изучено 312 образцов (кон­ троль) и 543 образца (после облучения); на культуре P. Aeruginosa — 380 (контроль) и 374 (после облуче­ ния); С. Albicans — 216 (контроль) и 208 (после об­ лучения). СЭМ-анализ образцов, подверженных облучению разными спектрами света, демонстрировал явные структурные и метаболические изменения в микроб­ ных клетках: нарушение формы, снижение четкости границ (см. рис. 1, ж—к), изменение относительной активности метаболизма и активности эффлюкс-сис- тем. Наиболее выраженные нарушения наблюдались в образцах, облученных зеленым светом (500 нм). Клетки S. aureus, облученные светом данного спек­ тра, на сканограммах имели неправильную форму и менее четкие границы по сравнению с контроль­ ным изображением (см. рис. 1, з, рис. 2). Наблюда­ лось увеличение числа ярко контрастированных то­ чек в границах клеток, что свидетельствует об увели­ чении активности эффлюкс-систем. На изображении С. albicans, подверженных облучению зеленым све­ том, клетки теряли округлость и приобретали непра­ вильную форму (см. рис. 1, н, рис. 2). Относительная активность метаболизма клеток, облученных зеленым светом, находилась на более низком уровне по сравнению с соответствующим по­ казателем других образцов (контрольных образцов и образцов, облученных другими спектрами света) для всех трех исследованных микроорганизмов (см. рис. 2). Для P. aeruginosa среднее значение относительной активности метаболизма после облучения зеленым светом составило 26 уел. ед. (р<0,01), после облучения другими спектрами света — не ниже 36 уел. ед. (при облучении красным светом — 37 уел. ед. (р<0,01), при облучении синим светом — 36 уел. ед. (/К0,01) и при облучении ультрафиолетом — 49 уел. ед. (р>0,05)). Для S. aureus данный показатель после облучения зеленым светом составлял 33 уел. ед. (р<0,01), по ­ сле облучения светом других спектров не изменялся (при облучении красным и синим светом — 45 уел. ед. (р>0,05)) или, напротив, повышался (после облу­ чения ультрафиолетом — 53 уел. ед. (/?>0,05)) по срав­ нению с контрольным образцом.

кроскопа (СЭМ) с предварительным контрастирова­ нием лантаноидами. Для этого пробы подготавливали следующим образом; к заселенной микроорганиз­ мами поверхности геля адгезивной стороной прижи­ мали стерильное гибкое покровное стекло Thermanox Plastic Coverslip 24x30 мм (Thermanox, Калифорния, США). Затем стекло с прилипшими к нему фрагмен­ тами колонии обрабатывали растворами для подго­ товки к сканирующей электронной микроскопии на основе хлорида неодима и ацетата свинца BioR.EE-В (ООО Глаукон, РФ). Проводку осуществляли по про­ токолу, описанному в методической статье [17]. Визуализацию осуществляли посредством СЭМ Zeiss EVO L S I0 (Zeiss, Германия) в режиме н и з ­ кого вакуума (ЕР=70 Па) при ускоряющем напря­ жении 21,5 кВ и токе зонда на образце 120—200пА. Изображения захватывались с разрешением 20,2 нм на 1 точку. Подробно метод визуализации описан [17]. Объем выборки в каждом случае составлял не­ сколько сотен индивидуальных замеров. Оценивали: 1. Общую метаболическую активность', для ее под­ счета проводили сравнение яркости изображения по- листироловой подложки и микробных клеток, пре­ вышение уровня яркости последних рассчитывали в условных единицах (уел. ед.). Яркость микробной клетки на сканограмме при использовании СЭМ с лантаноидным контрастированием прямо зависит от ее метаболической активности, определяемой ин ­ тенсивностью обмена фосфора. 2. Активность эффлюкс-систем —транспортных систем клеточной стенки микробной клетки, акти­ визирующихся при ее повреждении. Этот показатель можно оценить только у бактерий. В нашем исследо­ вании они визуализировались как точечные яркие об­ разования на клеточной стенке бактерий; оценивали долю клеток, их имеющих. 3. Морфологическую характеристику (форму и раз­ мер) микроорганизмов: увеличение размеров микроб­ ных клеток и изменение их формы (становилась не­ правильной) свидетельствовали о грубом их повреж­ дении, предшествующем гибели. Результаты На изображениях контрольных образцов S. Au­ reus, P. Aeruginosa и С. albicans, полученных при по­ мощи СЭМ с предварительным контрастированием лантаноидами, микробные клетки имеют типичную морфологию и четкие границы. Синегнойная палочка P. aeruginosa демонстрирует палочковидную форму, микробные клетки имеют размеры , равные при ­ мерно 2 мкм, и взаимное распределение друг с дру­ гом по отношению друг к другу (рис. 1, а, рис. 2). Стафилококки S. aureus имеют шаровидную форму (размер 0,8—1,2 мкм), высококонтрастные границы и плотно прилегают друг к другу (см. рис. 1, е, рис. 2).

45

RUSSIAN ANNALS OF OPHTHALMOLOGY 6, 2020